Makalah Variasi Somaklonal

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

A. Sejarah Kultur Jaringan

Kultur jaringan bila diartikan ke dalam bahasa Jerman disebut gewebe kultur atau tissue culture (Inggris) atau weefsel kweek atau weefsel cultuur (Belanda). Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagianbagian tersebut dapat memperbayak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap.

Keragaman genetik yang tinggi merupakan salah satu faktor penting untuk merakit varietas unggul baru. Peningkatan keragaman genetik dapat dilakukan dengan memanfaatkan plasma nutfah yang tersedia di alam dan dapat pula dengan melakukan persilangan. Sifat-sifattertentu sering tidak ditemukan pada sumber gen yang ada sehingga teknologi lainnya perlu diterapkan.Salah satunya adalah memperoleh variasi somaklonal melalui teknik kultur jaringan. Bab ini akan membahas mengenai mekanisme terjadinya variasi somaklonal melaluikultur jaringan.tanaman (biokimia dan fisika) dan berbagai macam pekerjaan analitik.

Kadang-kadang latar belakang pengetahuan tentang mikrobiologi, sitologi dan histologi. Pelaksana juga dituntut dalam hal ketrampilan kerja, ketekunan dan kesabaran yang tinggi serta harus bekerja intensif. Pekerjaan kultur jaringan meliputi: persiapan media, isolasi bahan tanam (eksplan), sterilisasi eksplan, inokulasi eksplan, aklimatisasi dan usaha pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri.

B. Variasi Somaklonal

Variasi somaklonal pertama kali dikemukakan oleh Larkin dan Scowcroft (1981), yang didefinisikan sebagai keragaman genetik dari tanaman yang dihasilkan melalui kultur sel, baik sel somatik seperti sel daun, akar, dan batang, maupun sel gamet. Skirvin (1993) mendefinisikan variasi somaklonal sebagai keragaman genetik tanaman yang dihasilkan melalui kultur jaringan. Variasi tersebut dapat berasal dari keragaman genetik eksplan yang digunakan atau yang terjadi dalam kultur jaringan. Keragaman genetik eksplan dapat terjadi akibat penggunaan zat pengatur tumbuh dan tingkat konsentrasinya, lama fase pertumbuhan kalus, tipe kultur yang digunakan (sel, protoplasma, kalus jaringan), serta digunakan atau tidaknya media seleksi dalam kultur in vitro. Variasi somaklonal yang terjadi dalam kultur jaringan merupakan hasil kumulatif dari mutasi genetik pada eksplan dan yang diinduksi pada kondisi in vitro. Variasi somaklonal merupakan perubahan genetik yang bukan disebabkan oleh segregasi atau rekombinasi gen, seperti yang biasa terjadi akibat proses persilangan.

BAB II

LATAR BELAKANG

A. Pengertian

Keragaman somaklonal adalah keragaman genetik yang dihasilkan melalui kultur jaringan. Keragaman somaklonal berasal dari keragaman genetic eksplan dan keragaman genetic yang terjadi dalam kultur jaringan, keragaman genetic pada eksplan disebabkan adanya sel bermutasi, Keragaman genetic yang terjadi didalam kultur jaringan disebabkan oleh penggandaan kromosom, perubahan struktur kromosom, perubahan gen maupun perubahan sitoplasma.

Teknik Mendapatkan Somaklonal

Ada tiga cara untuk mendapatkan tanaman somaklonal yaitu :

(1) Regenerasi langsung,

(2) Kultur sel tunggal,

(3) Kultur protoplasma.

1. Regenerasi langsung

Dengan regenerasi langsung dimaksudkan bahwa dari eksplan langsung diregenerasi tunas adventif dan embrio somatic tanpa melalui sel tunggal.

Cara regenerasi langsung :

Eksplant Tunas adventif Tanaman atau embrio

Eksplant Kalus Tunas adventif Tanaman atau embrio

Pada cara ini pemilihan eksplan dan media memegang peranan penting. Pemilihan eksplan untuk mendapat keragaman genetic juga penting didalam proses morfogenesis, media terutama untuk menghasilkan tunas atau embrio somatic. Pada tanaman kentang eksplan yang berasal dari daun lebih banyak memberikan keragaman genetic dari bagian eksplan lainnya. Keragaman somaklonal dapat ditingkatkan dengan pemberian mutagen pada eksplan, baik secara fisik maupun secara kimia. Pemberian mutagen pada eksplan akan menghasilkan mutan utuh ( solid mutan ) sedangkan pemberian mutagen pada kalus akan menghasilkan mutan parsial ( chimeric mutan ), pemuliaan in vitro dengan cara regenerasi langsung relative lebih mudah dibandingkan cara in vitro lainnya. Cara ini dapat dilakukan pada berbagai jenis bunga seperti : mawar, garbera, dianthus, anthurium, petunia, dll.

2. Kultur sel tungal

Prosedur seleksi melalui kultur sel dimulai dari penanaman dan pemilihan eksplan, induksi kalus, isolasi sel, penebaran sel, induksi tunas adventif, dan pemindahan kelapangan, genotip dan umur tanaman untuk dijadikan eksplan sangat menentukan proses selanjutnya ( pembentukan kalus dari regenerasi tunas ). Selain factor eksplan, factor media sangat menentukan keberhasilan organogenesis. Mulai dari penanaman eksplan sampai perakaran tunas terdapat enam macam media, yang terutama berbeda didalam komposisi ZPT.

Organogenesis tidak selalu membentuk tunas adventif atau embrio somatic, tetapi kadang-kadang juga akar, pada umumnya jika terbentuk akar sukar untuk berorganogenesis menjadi tunas kembali. Pada kultur sel tunggal, sel yang ditebar itu harus sel-sel yang mempunyai viabilitas tinggi dan berkemampuan untuk membelah, karena itu sebelum sel ditebar perlu diuji dengan viabilitas sel (pewarnaan dengan FDA), seleksi sel dan perhitungan jumlah sel per ml, sel-sel itu bisa ditebar dengan kepadatan 4-6 x 100.000 sel/ml, menyaring sel adalah untuk memisahkan sel-sel yang besar yang biasa mempunyai vakuola yang besar dan sitoplasma yang sedikit, sel yang demikian tidak mampu untuk membelah membentuk agregat sel. Hanya sel-sel dengan sitoplasma yang penuh (ukuran sedang) yang mampu membelah dan membentuk agregat dan kalus dan selanjutnya membentuk tunas adventif. Tekanan seleksi sudah dapat dilakukan mulai dari penebaran sel.

Tekanan seleksi pada tingkat sel ini hanya berlaku pada sifat-sifat ketahanan terhadap penyakit, kadar garam yang tinggi dan sifat0sifat lain yang sudah diekspresikan pada tingkat sel. Seleksi ini sebaiknya dilakukan pada M4, karena kalus pada tingkat itu pada umumnnya berasal dari satu sel, seleksi pada tingkat sel perlu diperlakukan lagi pada waktu kalus itu telah menjadi tanaman untuk meyakinkan bahwa sifat yang ditampilkan pada tingkat sel juga ditampilkan pada tingkat tanaman.

Seleksi dengan mempergunakan kultur sel ini adalah cara yang diinginkan pada seleksi in vitro tanaman bunga. Kultur sel mirip dengan kultur protoplasma tapi jauh lebih sederhana dari kultur protoplasma.

3. Kultur protoplasma

Kultur protoplasma merupakan salah satu cara untuk memperbaiki major gen atau poligen yang defektif pada kultivar yang ada. Sifat-sifat dari major gen itu berupa ketahanan terhadap penyakit, toleransi terhadap stress dan sifat-sifat morfologi tertentu.

Cara ini dilakukan untuk memperbaiki sifat beberapa jenis tanaman, terutama pada tanaman kentang, petunia, dan tomat, Sifat-sifat yang diperbaiki pada tanaman kentang berupa ketahanan terhadap penyakit, toleransi terhadap stress, bentuk dan warna kulit umbi serta sifat morfologis lainnya. Protoplas adalah sel yang telah dihilangkan dinding sel secara ensimatik atau sel telanjang.

Protoplas dipergunakan untuk memperbaiki tanaman melalui kultur protoplas, fusi protoplas dan transformasi, didalam kultur protoplas yang penting bahwa dapat diisolasi protoplas yang utuh, protoplas tersebut harus dapat membentuk dinding sel, kemudian membelah membentuk kalus dan meregenerasi tanaman.

Urutan didalam kerja protoplas adalah :

1. Penyiapan eksplan

2. Isolasi dan purifikasi protoplas

3. Penebaran protoplas

4. Rebenerasi protoplas kalus

5. Regenerasi planlet

Jenis eksplan yang dipergunakan untuk isolasi protoplas dapat berasal dari kultur suspensi, mesofil daun, kotiledon, hipokotil, tangkai daun, daun bunga, dan serbuk sari. Jenis eksplan ini dapat berasal dari in vivo atau in vitro. Pada umumnya dipergunakan eksplan in vitro dari kultur suspense dan kultur tunas.

Keuntungan dari eksplan in vitro adalah :

1.Eksplan tersebut steril.

2.Eksplan in vitro dikulturkan dan diinkubasikan pada keadaan optimum untuk menghasilkan protoplas serta proses organogenesis selanjutnya.

Isolasi protoplas dan purifikasi terdiri dari pelarutan dinding sel secara ensimatik dan pemisahan kotoranlain dari protoplasma dengan cara sentrifus. Sel tanaman terdiri dari selulose dan pectin sehingga enzim yang dipakai untuk menghilangkan dinding sel adalah selulose dan pektinase. Larutan yang dipergunakan untuk isolasi selain enzim, juga terdapat unsure hara dan osmotikum. Unsur hara untuk mempertahankan viabilitas protoplasma dan osmotikum untuk mencegah pecahnya protoplasma. Osmotikum umumnya terdiri dari gula (sukrosa, glucose dan gula alcohol).

Sesudah isolasi protoplasma dilakukan pengecekan viabilitas, perhitungan protoplasma dan pengenceran protoplasma. Viabilitas dilakukan denan cara mewarnai protoplas dengan FDA dan di teliti dibawah mikroskop. Perhitungan protoplas dilakukan dengan mempergunakan haemocymeter, perlu dilakukan pengenceran sebab sesudah isolasi itu kepadatan protoplas berkisar antara 100.000 dan 1000.000 protoplasma. Tiga sampai tujuh hari dalam media tebar, protoplas telah membelah dan membentuk agreat maka selanjutnya akan dipindah secara berurutan ke media p-kalus, media regenerasi tunas.

Media dasar yang dipergunakan untuk media kalus dan tunas adalah MS atau senyawa organik MS ditambah senyawa organic dari Nitsch dan Nitsch. Kadar sucrose dan ZPT berupa factor penentu didalam proses organogenesis. Kadar sucrose yang lebih tinggi dari 2% kadang-kadang menghambat pertumbuhan p-kalus, regenerasi p-kalus menjadi tunas sering membutuhkan sitokinin khusus seperti zeatin dan tidak dapat digantikan oleh BAP atai kinetin.
Intensitas cahaya tinggi (lebih dari 4000 luks) dan suhu sekitar 24 derajat celcius merupakan lingkungan inkubasi yang optimum untuk regenerasi p-kalus menjadi tunas. Untuk regenerasi protoplasma menjadi tunas membutuhkan waktu 12-16 minggu tergantung dari jenis tanaman dan genitofnya.

Tanaman regenerasi dari protoplasma menunjukkan keragaman genetic yang cukup tinggi. Umumnya keragaman ini dikarenakan perubahan kromosom dan perubahan gen. Keragaman ini lebih tinggi pada tanaman yang berasal dari protoplasma kultur suspense dari pada tanaman yang berasal dari protoplasma mesofil daun. Protoplasma juga dapat dipergunakan untuk memproduksi tanaman dengan ploidi yang lebih tinggi dari ploidi asal protoplasma.

Faktor-faktor yang mempengaruhi variasi somaklonal melalui kultur jaringan antara lain:

1) Tipe kultur yang digunakan (sel, protoplasma, kalus, jaringan),

2) Penggunaan zat pengatur tumbuh,

3) Lamanya fase pertumbuhan kalus, dan

4) Komposisi bahan kimia yang digunakan dalam media tanam. Penelitian yang dilakukan oleh Orton (1982) pada tanaman seledri menunjukkan bahwa 70% varietas seledri komersil yang diregenerasikan dari kultur jaringan kemudian ditumbuhkan di lapangan menunjukkan penampilan yang normal, sementara 30% lainnya menunjukkan laju pertumbuhan, bentuk dan warna daun serta pembungaan yang berbeda. Namun tidak satupun dari karakter tersebut dianggap lebih baik dari pada penampilan tanaman normal.

SEBERAPA JAUH VARIASI SOMAKLONAL SEBAGAI ALAT (TEKNIK) DAPAT DIANDALKAN?

Pertanyaan ini dapat dibagi menjadi tiga pertanyaan:

1) apakah kultur in vitro selalu meningkatkan

variasi?,

2) apakah variasi yang berguna selalu

berubah (recovered)?, dan

3) apakah variasi somaklonal dapat dimanfaatkan untuk semua spesies tanaman?

Apakah kultur in vitro selalu meningkatkan variasi?

Tidak selalu dapat dikatakan bahwa kultur invitro akan meningkatkan variasi. Kanyataannya, sejumlah faktor dapat diidentifikasi apakah berpengaruh atau tidak terhadap variasi yang dihasilkan dan seberapa banyak variasi yang dihasilkan.

Faktor- faktor tersebut adalah:

1) tingkat pertumbuhan awal organ meristematik,

2) konstitusi genetik materialawal,

3) zat pengatur tumbuh di dalam mediumkultur, dan

4) sumber jaringan atau eksplan (Karp, 1995).

Tingkat pertumbuhan awal organ meristematik. Pertumbuhan di dalam kultur dapat terjadi dari meristem yang sudah dibentuk atau dari bentuk yang tidak teratur sebagai kalus yang dihasilkan, dari embriogenesis somatik atau organogenesis. Tingkat pertumbuhan awal organ merupakan elemen kunci dalam variasi somaklonal, diduga bahwa dalam pertumbuhan yang tidak teratur, terjadi penahanan (pengurangan) pembatasan yang bertindak untuk mengeleminasi variasi genetik dalam meristem normal atau karena adanya mekanisme induksi ketidakstabilan genetik. Di pihak lain, semakin besar tingkat pertumbuhan organ dan semakin lama waktu yang digunakan tumbuh di media, maka semakin besar perubahan yang terjadi sebagai hasil variasi somaklonal.

Konstitusi genetik material awal. Banyak bukti mengindikasikan bahwa variasi somaklonal tergantung pada genotipe tanaman darimana eksplan berasal. Pada tahun 1982, McCoy telah meneliti pengaruh faktor genetik eksplan pada dua kultivar oat, dimana salah satu kultivar memberikan frekuensi keragaman jumlah kromosom yang lebih tinggi dibanding dengan kultivar lainnya (Larkin, 1987). Genotipe merupakan faktor penting di dalam menimbulkan variasi somaklonal, karena genotipe dapat mempengaruhi frekuensi regenerasi dan frekuensi variasi somaklonal yang terjadi (Karp, 1995).

Elemen genotipik merupakan aspek penting untuk identifikasi, karena pemulia tanaman yang menggunakan variasi somaklonal sebagai alat dalam galur atau kultivar tertentu dan untuk mengetahui apakah genotipe sebagai penentu variabilitas. Ploidi material awal merupakan salah satu faktor variasi somaklona1, Shepard et al. Sebagaimana diacu oleh Sutjahjo (1994), mencatat terjadinya frekuensi keragaman genotipe yang tinggi dari kultivar kentang Russet Burbank. Diperoleh ketidakstabilan kromosom pada regeneran yang poliploid dibandingkan dengan diploid atau haploid. Sun et al. sebagaimana diacu oleh Sutjahjo (1994), membandingkan besarnya frekuensi ploidi tanaman regenerasiin vitro dari 18 varietas padi. Ditemukanadanya multiploidi pada varietas indica sedangkan pada varietas japonika tidak ditemukan. Menurut Karp (1995), Mutasi gen akan mempunyai ekspresi yang lebih baik pada tanaman haploid dan diploid. Beberapa genom dapat lebih tidak stabil dibanding tanaman yang lainnya. Perbandingan suspensi sel diploid, tetraploid, hexaploid gandum memperlihatkan bahwa sel yang diploid lebih stabil dan yang heksaploid paling rendah kestabilannya (Winfield et al., 1993). Selanjutnya genom yang membawa elemen loncat (transposable elements) diperkirakan lebih tidak stabil dalam kultur dibanding yang tidak membawa elemen tersebut. Bukti tentang perubahan aktivitas transposon sebagai hasil kultur jaringan telah dilaporkan oleh Peschke etal. (1991), tetapi tidak semua perubahan yang terjadi pada kultur jaringan tanaman (yang mempunyai transposon) dicirikan oleh perpindahan transposon (Williams et al., 1991).

Lingkungan kultur (zat pengatur tumbuh di medium kultur). Menurut Karp (1995), banyak bukti menunjukkan bahwa variasi somaklonal dipengaruhi oleh pemilihan jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh di dalam media. Kemungkinan zat pengatur tumbuh tersebut bertindak seperti mutagen. Konsentrasi garam-garam nutrien yang tinggi seperti kalsium dan EDTA pada media kultur tampaknya meningkatkan ketidaknormalan kromosom pada kultur sel. Selanjutnya, konsentrasi sukrosa yang tinggi (10 atau 20 sampai 30 g L-1) dapat menginduksi poliploidisasi sel kalus yang dihasilkan dari lini dihaploid dan tetraploid. Auksin sintetik, 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) mampu meningkatkan mutasi sistem stamen pada Tradescantia dan erat kaitannya dengan keragaman tanaman regenerasi pada Hordeum (Dolezel and

Apakah variasi yang berguna selalu berubah (recovered)?

Dari percobaan lapang ekstensif yang dilakukan terhadap somaklon hasil regeneran dapat diketahui bahwa perubahan sifat-sifat agronomi yang terjadi merupakan hasil dari kultur in vitro. Namun tidak semua varian-varian yang dihasilkan diseleksi untuk tujuan pemuliaan tanaman dengan salah satu atau kombinasi alasan-alasan berikut:

1) variasi yang didapatkan ke arah yang salah (negatif) (Baillie et al., 1992),

2) perubahan positif yang terjadi tetapi diikuti sifat negatif (Qureshi et al., 1992),

3) tidak semua sifat yang didapatkan bersifat unik (noveltis) (Vuylsteke dan Swennen, 1990), dan

4) tidak semua perubahan genetik bersifat stabil atau perubahan genetik dan fenotip yang unpredictable (Seman dan Lepoivre, 1990), perubahan yang terjadi dapat bersifat non heritable atau epigenetic atau heritable tetapi dapat berubah kembali ke sifat awal (reversible change) (Karp, 1995).

Mutasi gen atau kromosom yang terjadi karena, misalnya amplifikasi dan transposisi dapat bersifat tidak stabil. Harus diakui hal ini menjadi "batu sandungan" dalam penggunaan variasi somaklonal untuk perbaikan sifat tanaman. Untuk mengimbanginya Karp (1989) sebagaimana diacu oleh Seman and Lepoivre (1990), menyarankan dengan laju variabilitas yang sangat tinggi, pengembangan teknik kultur yang sesuai, dan penggunaan metode seleksi yang sesuai untuk mengurangi material yang tidak dikehendaki atau dengan penggunaan metode seleksi awal.

Apakah variasi somaklonal dapat dimanfaatkan untuk semua spesies tanaman?

Dapat dikatakan bahwa variasi somaklonal telah berhasil memperbaiki sifat produksi beberapa tanaman seperti tomat, tebu, seledri, jagung, padi, dan sorgum Tetapi juga harus dikatakan tentang ketidaksuksesan beberapa percobaan dengan pendekatan ini, misalnya pada tanaman gandum, jagung, dan barley meskipun diusahakan dengan skala yang besar dan ekstensif (Maralappanavar et al., 2000). Pada evaluasi dengan menggunakan variasi somaklonal sebagai alat pemuliaan untuk memperbaiki kopi, Sondahl and Bragin (1991), menyimpulkan bahwa variasi sornaklonal adalah metode yang terbaik untuk memperpendek program pemuliaan kopi, sejak terbukti adanya akses untuk mendapatkan mutan baru dengan genotipe hasil tinggi disertai umur yang lebih genjah. Dari berbagai literatur yang ada, dapat disimpulkan variasi somaklonal akan lebih berhasil jika dilakukan pada tanaman dengan sistem genetik terbatas dan atau yang berdasarkan genetik dalam arti sempit.

Untuk tanaman hias, eksploitasi variabilitas dengan menggunakan teknik in vitro sudah merupakan Pekerjaan rutin program pemuliaan tanaman hias komersial. Hal ini bertolak belakang dengan tanaman- tanaman serealia seperti barley dan jagung di mana pendekatan variasi somaklonal belum berhasil dilakukan pada beberapa kasus (Baillie et al., 1992). Maskipun hasil (regeneran) dari variasi somaklonal tidak dapat diprediksi.

Beberapa kelebihannya dibandingkan dengan alat (teknik) lainnya adalah:

1) lebih murah dibandingkan dengan pendekatan bioteknologi dengan hibridisasi somatik dan transformasi genetik,

2) sistem kultur jaringan dapat menggunakan lebih banyak spesies tanaman Ahmad Riduan: Variasi Somaklonal sebagai Salah Satu Sumber Keragaman Genetik. 111 daripada manipulasi dengan hibridisasi somati dan transformasi genetik,

3) tidak perlu identifikasi sifat (trait) berdasarkan sifat genetik dibanding dengan transformasi yang memerlukan identifikasi genetik untuk isolasi dan kloning gen dimaksud, dan

4) dilaporkan varian-varian noveltis telah banyak dihasilkan di antara somaklon yang dihasilkan variasi somaklonal. Bukti genetik dan sitogenetik mengindikasikan bahwa frekuensi dan distribusi terjadinya rekombinasi genetik dapat diubah dengan jalan lintas melatui kultur jaringan.

KESIMPULAN

Variasi somaklonal dapat digunakan oleh parapemulia tanaman dalam rangka perbaikan sifat tanaman. Alat (teknik) ini bukan alat yang teliti tetapi dalam penggunaannya dilakukan dengan kontrol minimal. Pendekatan ini menawarkan secara cepat dan lebih mudah diakses untuk mendapatkan sumber keragaman genetik yang dapat digunakan pada program-program pemuliaan tanaman. Variasi somaklonal merupakan pilihan yang sangat mungkin untuk digunakan sebagai alat perbaikan tanaman dengan sistem genetik terbatas dan atau berdasarkan sifat genetik sempit (narrow genetic bases).

DAFTAR PUSTAKA

Kadir, A. 2007. Induksi Variasi Somaklon melalui Iradiasi Sinar Gama dan Seleksi In Vitro untuk Mendapatkan Tanaman Nilam Toleran terhadap Cekaman Kekeringan. Disertasi. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Keshavachandran, R dan Peter, KV. 2008. Methods in Tissue Culture and Gene Transfer. India : Universities Press

Orton, Thomas J., 1982. Somaclonal variation. California Agriculture, hal: 20-21.

Rasheed, Sultana., Tahira Fatima, Tayyab Husnain, Khurram Bashir dan Shiekh Riazuddin.2005. RAPD

Characterization Of Somaclonal Variation In Indica Basmati Rice. Pak. J.Bot., 37(2): 249-262.

Sandra, Edhi. 2010. Kultur Anter. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html, diakses pada tanggal 18 November 2011.

Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamtan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima.

Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press.

Wetter, L.R., dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan olehWidianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua. Bandung:Penerbit ITB.

Yuwono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Yunita, Rossa. 2009. Pemanfaatan Variasi Somaklonal Dan Seleksi In Vitro Dalam PerakitanTanaman Toleran Cekaman Abiotik. Bogor:Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta: Bumi Aksara.